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無細胞タンパク質合成
テクニカルインフォメーション

より便利にお使いいただくために、無細胞くんSI 無細胞くんQuick の取扱仕様を変更いたしました。お手元のLOT#をご確認の上、取扱説明書をご選択ください。

無細胞くんSI
「タンパク質合成操作」

無細胞くんQUICK
「タンパク質合成操作」

  • Q1:タンパク質が発現しない、または発現量が少ない。

  • Q2:どのベクターを使用すれば良いかわからない。

  • Q3:直鎖状テンプレートDNAの調製方法がわからない。

  • Q4:発現確認のためのSDS-PAGE用サンプル調製方法がわからない。

A1:(1)無細胞くんQuickの場合

考えられる要因 推奨する対策
キット性能の低下 (1)製品ラベルに記載の使用期限内であることをご確認ください。
(2)適正な温度で保管されていたかご確認ください。
(3)使用期限内で適正に保管されていた場合は、弊社までお問い合わせください。
テンプレートDNAが不適切 テンプレートDNAの配列が適切かご確認ください。濃度が適切かをアガロースゲル電気泳動でご確認ください。市販のプラスミド精製キット等で調製したプラスミドDNAを用いる場合、プラスミドDNA精製標品に残留するヌクレアーゼの影響でタンパク質再現量が低下したり、まったく再現しないことがあります。この場合プラスミドDNAの再精製により改善することがあります。フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による再精製処理を実施してください。
タンパク質の性質による問題 タンパク質によっては反応中に容易に分解や沈殿してしまう傾向のものがあります。
可溶性を向上させるタグ配列の挿入で可溶性が向上する場合があります。発現領域や末端配列のアミノ酸組成によって発現量が大きく異なりますのでタンパク質に応じたコンストラクトの最適化を行ってください。

A1:(2)無細胞くんSIの場合

考えられる要因 推奨する対策
キット性能の低下 (1)製品ラベルに記載の使用期限内であることをご確認ください。
(2)適正な温度で保管されていたかご確認ください。
(3)使用期限内で適正に保管されていた場合は、弊社までお問い合わせください。
テンプレートDNAが不適切 (1)発現確認を無細胞くんQuickで行ってください。
(2)テンプレートDNAの配列が適切かご確認ください。濃度が適切かをアガロースゲル電気泳動でご確認ください。市販のプラスミド精製キット等で調製したプラスミドDNAを用いる場合、プラスミドDNA精製標品に残留するヌクレアーゼの影響でタンパク質再現量が低下したり、まったく再現しないことがあります。この場合プラスミドDNAの再精製により改善することがあります。フェノール・クロロホルム抽出、エタノール沈殿による再精製処理を実施してください。
(3)無細胞くんQuickで発現確認されたにも関わらず、無細胞くんSIで発現が確認されない場合は、弊社までお問い合わせください。
タンパク質の性質による問題 タンパク質によっては反応中に容易に分解や沈殿してしまう傾向のものがあります。4時間程度の短時間反応で回収し、発現量を再度ご確認ください。配列への変異導入やコンストラクトの再設計で改善される場合があります。

A2:T7プロモーター、RBS、T7ターミネーター配列を持つT7RNAポリメラーゼでmRNAを転写可能な市販の発現ベクターがお使いいただけます。ただし、ベクターの種類により発現量が異なる場合もあります。また、コピー数の少ないプラスミドでは調製時の培養スケールが大きくなり、純度が低くなることが想定されますのでコピー数の多いものをお勧めいたします。サイズの大きなプラスミドでは、添加量を増やす必要があります。最適なプラスミドの濃度を決定するために添加量を変えて合成量をご確認ください。

A3:調製方法は次の参考文献に詳しく記載されています。恐れ入りますがご参照、ご確認願います。
Yabuki et al J Struct Funct Genomics 8(4) 173-191 2007

A4:反応終了後の液①から5 μLを0.6 mLエッペンチューブに移します(Total)。
①を12000 rpmで5分間遠心分離し、上清5 μLを0.6 mLエッペンチューブに移します(Sup)。
Total及びSupそれぞれにMilliQ水45 μLと冷アセトン100 μLを加え、氷上で5分程静置後、12000 rpmで5分間遠心分離し、上清を捨てます。沈殿を乾固し、50~100 μLのSDS-PAGEサンプルバッファーを加え、ボイル、溶解してSDS-PAGEに供します。


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